1. Принципы ускоренного роговичного коллагенового кросслинкинга

#### 1.3.1.3. Подготовка ткани Кросслинкинг in vitro обычно проводят на целых глазных яблоках человека или различных животных. Предварительное кондиционирование глазных яблок — первый и необходимый шаг для получения воспроизводимых лабораторных результатов: так стабилизируется гидратация ткани. Кроме того, поскольку кросслинкинг роговицы — фотохимический процесс, колебания температуры могут менять динамику реакции и влиять на количество сшивок и последующий механический ответ ткани [65]. Поэтому при экспериментальном кросслинкинге, помимо поддержания внутриглазного давления, рекомендуется поддерживать физиологическую температуру и гидратацию глазных яблок. Это помогает обеспечить точность и правильность экспериментальных измерений.

#### 1.3.1.4. Мониторинг кислорода Мониторинг кислорода может служить и косвенным способом понять химико-кинетические механизмы кросслинкинга роговицы [66]. В этом методе уровень кислорода измеряют датчиком O₂. На роговицу закапывают раствор рибофлавина и затем облучают её УФА 365 нм при разной облучённости и температуре. Во время облучения УФА контролируют концентрацию кислорода в роговице на известной глубине. Динамику кислорода затем используют, чтобы понять механизмы кросслинкинга роговицы.

#### 1.3.1.5. Химическое переваривание Химическое переваривание ферментами для измерения сшивания роговицы впервые применили Шпёрль и соавт. [47]. В этом эксперименте свиные роговицы облучали тремя разными дозами. Затем роговицы трепанировали и подвергали перевариванию разными ферментами. Устойчивость к ферментативной деградации измеряли в зависимости от времени; было показано, что усиление сшивания роговицы повышает устойчивость к перевариванию. Ферментативное переваривание для изучения кросслинкинга роговицы применяли и ряд других авторов [18, 67, 68].

Другой метод ферментативного переваривания использует фермент папаин в сочетании со спектрофлуориметрическим анализом, чтобы количественно оценить сшивание в свиных роговичных лоскутах после различных протоколов кросслинкинга рибофлавином и УФА [69]. Этот метод обеспечивает использование одинакового количества ткани, сводя к минимуму разброс толщины роговицы, часто наблюдаемый при одноосных испытаниях.

В этом методе свиные глазные яблоки кондиционируют, как описано выше, и обрабатывают по различным протоколам кросслинкинга. После кросслинкинга фемтосекундным лазером вырезают роговичные лоскуты разной толщины. Толщину лоскутов подтверждают ультразвуковой пахиметрией. Для подготовки к перевариванию лоскуты 15 раз промывают дистиллированной водой, чтобы удалить остатки рибофлавина, и высушивают под вакуумом, пока изменение массы не станет менее 10%. Каждый лоскут переваривают 2,5 ч при 65 °C с папаином 2,5 ед/мл (из латекса папайи, Sigma) в 1 мл папаинового буфера [1× PBS (pH 7,4), 2 мМ L-цистеина и 2 мМ ЭДТА]. Продукты переваривания папаином центрифугируют 20 с при 2200 × g (миницентрифуга 05-090-100, Fisher Scientific) и разводят в 0,5 раза раствором 1× PBS.

Флуоресценцию растворов переваренных роговичных лоскутов измеряют при возбуждении λex = 360 нм на спектрофлуориметре QM-40 (Photon Technology Int., Лондон, Онтарио, Канада), регистрируя эмиссию флуоресценции в диапазоне от 375