Адгезия мигрирующих эпителиальных клеток роговицы к матриксу фибронектина опосредуется интегринами, которые представляют собой семейство белков-рецепторов клеточной поверхности. На сегодняшний день было показано, что это семейство включает 24 различных α-субъединиц и девять различных β-субъединиц, при этом селективная комбинация этих α- и β-субъединиц определяет специфичность связывания с белками ВКМ. В роговице человека были обнаружены субъединицы интегринов α2, α3, α5, α6, αv, β1, β4 и β5.[136] Связывание интегринов α5β1, αvβl и αIIβ3 с фибронектином опосредуется последовательностью RGD. Появление и исчезновение цепи интегрина β1 и фибронектина в процессе заживления ран эпителия роговицы хорошо скоординированы (Рис. 1.13).[83] Сразу после разреза роговицы крысы на поверхности V-образного дефекта в строме обнаруживался фибронектин. Затем эпителиальные клетки, экспрессирующие субъединицу интегрина β1, начали мигрировать и заполнять дефект. За исключением базальных клеток, экспрессия цепи интегрина β1 в эпителиальных клетках снижалась одновременно с завершением заживления раны. Количество фибронектина на границе между новым эпителием и стромой в это время также заметно снижалось.
Adhesion of migrating corneal epithelial cells to a fibronectin matrix is mediated by integrins, which constitute a family of cell surface receptor proteins. To date, this family has been shown to include 24 different α subunits and nine different β subunits, with the selective combination of these α and β subunits determining the specificity of binding to ECM proteins. The integrin subunits α2, α3, α5, α6, αv, β1, β4, and β5 have been detected in the human cornea.[136] The binding of integrins α5β1, αvβl, and αIIβ3 to fibronectin is mediated by the RGD sequence. The appearance and disappearance of the integrin β1 chain and fibronectin during corneal epithelial wound healing are well coordinated (Fig. 1.13).[83] Immediately after an incision to the rat cornea, fibronectin was detected on the surface of the V-shaped defect in the stroma. Epithelial cells expressing the integrin β1 subunit then began to migrate over and to fill in the defect. With the exception of that in basal cells, expression of the integrin β1 chain in epithelial cells was down-regulated coincident with the completion of wound healing. The abundance of fibronectin at the interface between the new epithelium and the stroma also markedly decreased at this time.
Рис. 1.13 Изменения локализации цепи интегрина β1, фибронектина и ламинина после непроникающего разреза роговицы крысы.
Fig. 1.13 Changes in the localization of the integrin β1 chain, fibronectin, and laminin after a nonpenetrating incision in the rat cornea.
Гетеродимер интегрина α6β4 является компонентом гемидесмосом и не связан с опосредованной фибронектином адгезией и миграцией клеток. В ответ на повреждение эпителия роговицы гемидесмомы в базальном слое клеток разрушаются. В конечном итоге они снова появляются после того, как миграция оставшегося эпителия привела к восстановлению обнаженной области.[137]
The integrin α6β4 heterodimer is a component of hemidesmosomes and is not related to fibronectin-mediated cell adhesion and migration. In response to wounding of the corneal epithelium, hemidesmosomes in the basal cell layer are disassembled. They eventually reappear after migration of the remaining epithelium has resulted in a recovering of the denuded area.[137]
Гиалуронан
Hyaluronan
Гиалуронан также признан биологической сигнальной молекулой и, подобно фибронектину, играет важную роль в воспалении и заживлении ран.[138] В нормальной роговице гиалуронан отсутствует. В отличие от других гликозаминогликанов, основной белок для связывания гиалуронана до сих пор не идентифицирован. Гиалуронан транзиторно экспрессируется в роговице кролика во время заживления ран.[139],[140] Эти наблюдения позволяют предположить, что гиалуронан играет ключевую роль на поздних стадиях заживления ран роговицы.
Hyaluronan is also recognized as a biological signaling molecule and, like fibronectin, plays an important role in inflammation and wound healing.[138] Hyaluronan is not present in the normal cornea. Unlike other glycosaminoglycans, a core protein for hyaluronan binding has not yet been identified. Hyaluronan is transiently expressed in the rabbit cornea during wound healing.[139],[140] These observations suggest that hyaluronan plays a key role in the late stages of corneal wound healing.
Экзогенный гиалуронан также увеличивает скорость заживления ран эпителия роговицы. Таким образом, применение капель гиалуронана способствует закрытию ран эпителия роговицы после дебридмента эпителия у кроликов[141] и у крыс с сахарным диабетом.[142],[143]
Exogenous hyaluronan also increases the rate of corneal epithelial wound healing. The administration of hyaluronan eyedrops thus promotes corneal epithelial wound closure after epithelial debridement in rabbits[141] and in diabetic rats.[142],[143]
Протеолитические ферменты
Proteolytic enzymes
Протеолитические ферменты также играют важную роль в заживлении ран. Подвижность клеток зависит не только от взаимодействия клеток с нижележащим ВКМ, но и от прекращения такого взаимодействия путем деградации белков матрикса. В слезной жидкости были обнаружены протеазы, включая активатор плазминогена.[143–146] ММП также экспрессируются в повышенном количестве в мигрирующем эпителии роговицы.[147]
Proteolytic enzymes also play an important role in wound healing. Cellular motility depends not only on the interaction of cells with the underlying ECM but also on the termination of such interaction by degradation of matrix proteins. Proteases, including plasminogen activator, have been detected in tear fluid.[143–146] MMPs are also up-regulated in the migrating corneal epithelium.[147]
Цитокины и факторы роста
Cytokines and growth factors
Эпидермальный фактор роста
Epidermal growth factor
Также изучалась роль различных цитокинов и факторов роста в регуляции миграции эпителия роговицы.[148] В целом, эти молекулы модулируют заживление ран эпителия роговицы, регулируя различные описанные выше системы, связанные с заживлением.
The roles of various cytokines and growth factors in the regulation of corneal epithelial migration have also been investigated.[148] In general, these molecules modulate corneal epithelial wound healing by regulating the various healing-related systems described above.
Эпидермальный фактор роста (EGF) был впервые выделен из поднижнечелюстной железы мыши как фактор, стимулирующий открытие глаз и прорезывание резцов у новорожденных мышей.[149] Этот полипептид из 53 аминокислот является мощным стимулятором пролиферации различных типов клеток, включая эпителиальные клетки роговицы.[150],[151] Было также обнаружено, что он способствует закрытию ран эпителия роговицы у животных.[152],[153]
Epidermal growth factor (EGF) was first isolated from the mouse submaxillary gland as a factor that stimulates eye opening and incisory tooth eruption in newborn mice.[149] This 53-amino acid polypeptide is a potent stimulator of proliferation in a variety of cell types, including corneal epithelial cells.[150],[151] It was also found to promote corneal epithelial wound closure in animals.[152],[153]
Постоянное воздействие EGF, присутствующего в слезной жидкости, на эпителий роговицы позволяет предположить, что стимулирующий эффект этого фактора роста на пролиферацию эпителиальных клеток должен быть уравновешен, чтобы поддерживалась нормальная толщина и функция эпителия. Помимо стимулирующего влияния на пролиферацию клеток, EGF оказывает ряд других воздействий на эпителиальные клетки роговицы, включая стимуляцию адгезии клеток к матриксу фибронектина.[154],[155]
The continuous exposure of the corneal epithelium to EGF present in tear fluid suggests that the stimulatory effect of this growth factor on epithelial cell proliferation must be counteracted if the normal thickness and function of the epithelium are to be maintained. In addition to its stimulatory effect on cell proliferation, EGF exerts a variety of other actions in corneal epithelial cells, including promotion of cell adhesion to a fibronectin matrix.[154],[155]
Трансформирующий фактор роста-β
Transforming growth factor-β
Эпителиальные клетки роговицы экспрессируют трансформирующий фактор роста (TGF)-β1.[156] Стимулирующее действие EGF на пролиферацию эпителиальных клеток роговицы, их прикрепление к фибронектину и миграцию модулируется TGF-β.[157],[158] Хотя сам по себе TGF-β подавляет пролиферацию эпителиальных клеток роговицы, он не влияет на прикрепление клеток к матриксу фибронектина в отсутствие EGF. Эндогенный TGF-β также способствует миграции эпителиальных клеток роговицы.
Corneal epithelial cells express transforming growth factor (TGF)-β1.[156] The stimulatory effects of EGF on corneal epithelial cell proliferation, attachment to fibronectin, and migration are modulated by TGF-β.[157],[158] Although TGF-β alone inhibits corneal epithelial cell proliferation, it has no effect on cell attachment to a fibronectin matrix in the absence of EGF. Endogenous TGF-β also promotes corneal epithelial cell migration.
Основной фактор роста фибробластов и тромбоцитарный фактор роста
Basic fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor
Основной фактор роста фибробластов (bFGF) — это еще один полипептидный фактор роста, который стимулирует пролиферацию различных типов клеток мезодермального или нейроэктодермального происхождения.[159] Было показано, что применение рекомбинантного человеческого bFGF (200–500 нг дважды в день) ускоряет закрытие ран эпителия роговицы у кроликов.[160] Эпителиальные клетки роговицы кролика также экспрессируют рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGF) как β-, так и α-типа с плотностью 4.3 × 104 и 2.8 × 103/клетку соответственно.[161] В соответствии с этим наблюдением, изоформы BB и AB PDGF повышали цитозольную концентрацию свободного Ca2+ в этих клетках. Хотя Ca2+ задействован в качестве вторичного посредника в регуляции ряда функций во многих типах клеток, роль этого иона в заживлении ран эпителия роговицы еще предстоит определить.
Basic fibroblast growth factor (bFGF) is another polypeptide growth factor that stimulates the proliferation of various cell types of mesodermal or neuroectodermal origin.[159] The application of recombinant human bFGF (200–500 ng, twice a day) was shown to accelerate corneal epithelial wound closure in rabbits.[160] Rabbit corneal epithelial cells also express both the β and α type of receptors for platelet-derived growth factor (PDGF) at a density of 4.3 × 104 and 2.8 × 103/cell, respectively.[161] Consistent with this observation, the BB and AB isoforms of PDGF increased the cytosolic concentration of free Ca2+ in these cells. Although Ca2+ is implicated as a second messenger in regulation of a variety of functions in many cell types, a role for this ion in corneal epithelial wound healing remains to be determined.
Интерлейкины
Interleukins
Интерлейкины — это цитокины, которые регулируют функцию иммунной системы, воспаление и другие реакции тканей на внешние стимулы.[162] Они модулируют активность иммунных или воспалительных клеток как локально в тканях, так и системно в кровотоке и костном мозге. Хотя на сегодняшний день было идентифицировано 35 членов семейства интерлейкинов (от IL-1 до IL-35), роль многих из этих белков в заживлении ран роговицы еще предстоит изучить. Например, эпителий роговицы экспрессирует IL-1, а экзогенный IL-1 способствует заживлению ран эпителия роговицы.[163] Эпителиальные клетки роговицы также экспрессируют IL-6.[164] Воздействие IL-6 на культуру эпителиальных клеток роговицы кролика привело к заметному увеличению числа клеток, прикрепившихся к матриксу фибронектина. IL-6 стимулирует экспрессию интегрина α5β1 в эпителиальных клетках роговицы, что позволяет предположить, что этот цитокин может регулировать миграцию эпителия роговицы посредством модуляции системы фибронектин-интегрин.[53,165,166]
Interleukins are cytokines that regulate the function of the immune system, inflammation, and other reactions of tissue to external stimuli.[162] They modulate the activities of immune or inflammatory cells both locally in tissue as well as systemically in the circulation and in bone marrow. Although 35 members of the interleukin family (IL-1 to IL-35) have been identified to date, the roles of many of these proteins in corneal wound healing remain to be investigated. For example, the corneal epithelium expresses IL-1, and exogenous IL-1 promotes the healing of corneal epithelial wounds.[163] Corneal epithelial cells also express IL-6.[164] Exposure of rabbit corneal epithelial cells in culture to IL-6 resulted in a marked increase in the number of cells that attached to a fibronectin matrix. IL-6 stimulates the expression of integrin α5β1 in corneal epithelial cells, suggesting that this cytokine may regulate corneal epithelial migration through modulation of the fibronectin–integrin system.[53,165,166]
Нервная регуляция
Neural regulation
Физиологическая роль иннервации роговицы в заживлении ран эпителия роговицы еще не до конца выяснена. Однако потеря чувствительности роговицы часто приводит к нарушению ее нормальной целостности. Стойкие дефекты эпителия роговицы или замедленное заживление эпителиальных ран часто наблюдаются у лиц с пониженной чувствительностью роговицы, например, у инфицированных вирусом простого герпеса или вирусом опоясывающего лишая, а также у больных сахарным диабетом. Злоупотребление местными анестетиками также нарушает миграцию эпителия роговицы в системе органных культур.[167] Более того, было показано, что в анестезированных глазах может развиться явная язва роговицы. Таким образом, эти различные наблюдения указывают на роль нервной регуляции в поддержании и восстановлении эпителия роговицы.
The physiological role of corneal innervation in corneal epithelial wound healing remains to be fully clarified. The loss of corneal sensation, however, often results in breakdown of the normal integrity of the cornea. Persistent corneal epithelial defects or delayed epithelial wound healing are frequently observed in individuals with a reduced corneal sensation, such as those infected with herpes simplex or herpes zoster virus as well as those with diabetes mellitus. Abuse of topical anesthetics also impairs corneal epithelial migration in an organ culture system.[167] Furthermore, frank corneal ulceration has been shown to develop in anesthetized eyes. These various observations thus implicate neural regulation in maintenance and repair of the corneal epithelium.
Как обсуждалось ранее, роговица густо иннервирована чувствительными нервными волокнами тройничного нерва, которые содержат сенсорный нейромедиатор вещество P. Считается, что вещество P регулирует различные физиологические процессы, включая экстравазацию плазмы, вазодилатацию и высвобождение гистамина из тучных клеток.[168–171] Воздействие на культуру эпителиальных клеток роговицы кролика комбинации вещества P и инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) привело к заметному увеличению числа клеток, прикрепившихся к матриксу фибронектина.[154] Вещество P также задействовано в нейрональных реакциях на различные стимулы в глазу, а также в других тканях.[20,172,173]
As discussed earlier, the cornea is densely innervated by sensory nerve fibers of trigeminal nerve origin which contain the sensory neurotransmitter substance P. Substance P is thought to regulate various physiological processes, including plasma extravasation, vasodilatation, and the release of histamine from mast cells.[168–171] Exposure of rabbit corneal epithelial cells in culture to the combination of substance P and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) resulted in a marked increase in the number of cells that attached to a fibronectin matrix.[154] Substance P has also been implicated in neuronal responses to various stimuli in the eye as well as in other tissues.[20,172,173]
Денервация тройничного нерва коррелирует со снижением содержания вещества P в роговице.[174] Пересечение тройничного нерва приводит к трофическим или дегенеративным изменениям в роговице, а также к истощению запасов вещества P.[175] Таким образом, вещество P может способствовать поддержанию нормальной целостности эпителия роговицы. Комбинация вещества P и IGF-1 синергически стимулирует миграцию эпителия роговицы, при этом ни один из этих агентов в отдельности не оказывает влияния на этот процесс. Кроме того, было показано, что применение глазных капель, содержащих IGF-1 и либо вещество P, либо тетрапептид, производный от его карбоксильного конца, является эффективным методом лечения стойких дефектов эпителия роговицы у лиц с нейротрофическим кератитом или диабетической нейропатией.[176–178]
Trigeminal denervation correlates with a reduction in the abundance of substance P in the cornea.[174] Sectioning of the trigeminal nerve results in trophic or degenerative changes in the cornea as well as in the depletion of substance P.[175] Substance P may thus contribute to maintenance of the normal integrity of the corneal epithelium. The combination of substance P and IGF-1 synergistically promotes corneal epithelial migration, with neither agent alone having an effect on this process. Furthermore, the administration of eyedrops containing IGF-1 and either substance P or a tetrapeptide derived from its carboxyl terminus has been shown to be an effective treatment for persistent corneal epithelial defects in individuals with neurotrophic keratopathy or diabetic neuropathy.[176–178]
Фактор роста нервов (NGF), впервые открытый Леви-Монтальчини в начале 1950-х годов,[179] представляет собой полипептид, который стимулирует регенерацию периферических нервных волокон.[180] Кроме того, глазные капли, содержащие NGF, способствуют восстановлению при стойких дефектах эпителия роговицы у животных и людей.[181–185]
Nerve growth factor (NGF), first discovered by Levi-Montalcini in the early 1950s,[179] is a polypeptide that stimulates the regeneration of peripheral nerve fibers.[180] Furthermore, eyedrops containing NGF promote resurfacing of persistent corneal epithelial defects in animals and humans.[181–185]
Поддержание стромы
Stromal maintenance
Внеклеточный матрикс и восстановление стромы
Extracellular matrix and stromal repair
Таким образом, структурный и биохимический гомеостаз внеклеточного матрикса (ВКМ) в строме роговицы поддерживается балансом регуляции синтеза и деградации компонентов ВКМ кератоцитами. В ответ на повреждение роговицы кератоциты трансдифференцируются в миофибробласты и активно вырабатывают компоненты матрикса для заживления поврежденной стромы, при этом каждая вновь экспрессируемая макромолекула, по-видимому, играет важную роль в процессе восстановления.
Structural and biochemical homeostasis of the ECM in the corneal stroma is thus maintained by a balance in the keratocyte regulation of the synthesis and degradation of ECM components. In response to corneal injury, keratocytes transdifferentiate into myofibroblasts and actively produce matrix components for healing of the injured stroma, with each newly expressed macromolecule appearing to play an important role in the repair process.