Мембрана Десцеме состоит преимущественно из коллагенов IV и VIII типов и ламинина[117], но также содержит фибронектин.[118],[119] Коллаген VIII типа, который вырабатывается эндотелием роговицы, образует гексагональную решетку, которая существенно отличается по структуре от коллагена IV типа в базальной мембране. Коллагеновые фибриллы в строме непрерывно переходят в фибриллы слоя Боумена, но не в фибриллы мембраны Десцеме. Мембрана Десцеме плотно прилегает к задней поверхности стромы роговицы и отражает любые изменения формы стромы. Разрыв мембраны Десцеме вследствие физического воздействия, такого как компрессионная травма при родах, приводит к проникновению водянистого юмора в строму роговицы и последующему отеку стромы. Мембрана Десцеме не регенерирует после того, как эндотелиальные клетки вновь закрывают область разрыва. Такие заболевания, как дистрофия Фукса, сопровождаются атипичным полосчатым рисунком отложения коллагена в мембране Десцеме.[120] У пациента с ранним началом дистрофии Фукса была обнаружена мутация в COL8A2,[121], который кодирует цепь α2 коллагена VIII типа.
Descemet's membrane is composed primarily of collagen types IV and VIII and laminin[117] but also contains fibronectin.[118],[119] Type VIII collagen, which is produced by the corneal endothelium, forms a hexagonal lattice that is substantially different from the structure of type IV collagen in the basement membrane. Collagen fibrils in the stroma are continuous with those in Bowman's layer but not with those in Descemet's membrane. Descemet's membrane adheres tightly to the posterior surface of the corneal stroma and reflects any change in the shape of the stroma. Rupture of Descemet's membrane by physical stress, such as compression birth injury, results in the penetration of aqueous humor into the corneal stroma and consequent stromal edema. Descemet's membrane does not regenerate after endothelial cells re-cover the ruptured area. Diseases such as Fuchs’ dystrophy are associated with an atypical striated pattern of collagen deposition in Descemet's membrane.[120] A patient with early-onset Fuchs’ dystrophy was found to harbor a mutation in COL8A2,[121] which encodes the α2 chain of type VIII collagen.
Эндотелий
Endothelium
Одиночный слой эндотелиальных клеток роговицы покрывает заднюю поверхность мембраны Десцеме в виде хорошо организованного мозаичного рисунка (Рис. 1.11). Эти клетки имеют равномерную толщину 5 µm и ширину 20 µm и многоугольную (преимущественно шестиугольную) форму. Равномерность размера эндотелиальных клеток оценивалась с помощью статистического анализа фотографий, сделанных на широкопольный зеркальный микроскоп. У молодых взрослых плотность клеток составляет около 3500 клеток/мм2. Коэффициент вариации средней площади клеток (стандартное отклонение средней площади клеток / средняя площадь клеток) является клинически ценным маркером и составляет около 0.25 в нормальной роговице. Увеличение вариабельности площади клеток называется полимегатизмом. Другим морфометрическим параметром состояния эндотелия является гексагональность. В нормальной здоровой роговице около 70–80% эндотелиальных клеток имеют шестиугольную форму. Однако повреждение эндотелия может привести к снижению показателя гексагональности и увеличению вариабельности площади клеток (Рис. 1.11). Отклонение от гексагональности называется плеоморфизмом.
A single layer of corneal endothelial cells covers the posterior surface of Descemet's membrane in a well-arranged mosaic pattern (Fig. 1.11). These cells are uniformly 5 µm in thickness and 20 µm in width and are polygonal (mostly hexagonal) in shape. The uniformity of endothelial cell size has been evaluated by statistical analysis based on photographs taken by a wide-field specular microscope. In young adults, the cell density is about 3500 cells/mm2. The coefficient of variation of mean cell area (standard deviation of mean cell area/mean cell area) is a clinically valuable marker and is about 0.25 in the normal cornea. An increase in the variability of cell area is termed polymegathism. Another morphometric parameter of the state of the endothelium is hexagonality. In the normal healthy cornea, about 70–80% of endothelial cells are hexagonal. However, endothelial damage can result in a decrease in the hexagonality value and an increase in the variability of cell area (Fig. 1.11). Deviation from hexagonality is referred to as pleomorphism.
Рис. 1.11 Сканирующая электронная микроскопия эндотелиальных клеток роговицы кролика in situ (A) и зеркальная микроскопия эндотелия как в нормальной роговице человека (B), так и в роговице пациента с буллезной кератопатией (C). Обратите внимание на неправильный характер и увеличенный размер эндотелиальных клеток, характерных для буллезной кератопатии.
Fig. 1.11 Scanning electron microscopy of rabbit corneal endothelial cells in situ (A) and specular microscopy of the endothelium in both a normal human cornea (B) and the cornea of an individual with bullous keratopathy (C). Note the irregular nature and enlarged size of endothelial cells associated with bullous keratopathy.
Эндотелиальные клетки содержат крупное ядро и большое количество цитоплазматических органелл, включая митохондрии, эндоплазматический ретикулум, свободные рибосомы и аппарат Гольджи (Рис. 1.12), что свидетельствует об их высокой метаболической активности. Эндотелиальные клетки переплетаются между собой и содержат различные соединительные комплексы, включая zonula occludens, macula occludens и macula adherens. Кроме того, щелевые контакты обеспечивают перенос малых молекул и электролитов между эндотелиальными клетками. Взаимосвязанный слой эндотелиальных клеток создает проницаемый барьер для водянистого юмора.
Endothelial cells contain a large nucleus and abundant cytoplasmic organelles, including mitochondria, endoplasmic reticulum, free ribosomes, and Golgi apparatus (Fig. 1.12), suggesting that they are metabolically active. The endothelial cells interdigitate and contain various junctional complexes, including zonula occludens, macula occludens, and macula adherens. In addition, gap junctions allow the transfer of small molecules and electrolytes between the endothelial cells. The interconnected endothelial cell layer provides a leaky barrier to aqueous humor.
Рис. 1.12 Просвечивающая электронная микроскопия эндотелия роговицы человека.
Fig. 1.12 Transmission electron microscopy of the human corneal endothelium.
Потеря или повреждение эндотелиальных клеток роговицы приводит к усилению имбибиции воды стромой роговицы. Эндотелиальные клетки содержат системы транспорта ионов, которые противодействуют имбибиции воды в строму. Между водянистым юмором (143 мЭкв/л) и стромой (134 мЭкв/л) существует осмотический градиент Na+. Этот градиент приводит к потоку Na+ из водянистого юмора в строму и потоку K+ в противоположном направлении. Na+- и K+-зависимая АТФаза и Na+/H+-обменник экспрессируются в базолатеральной мембране эндотелиальных клеток роговицы. Диоксид углерода также диффундирует в цитоплазму этих клеток и вместе с водой образует бикарбонат-ионы (HCO3−) в реакции, катализируемой карбоангидразой. Затем HCO3− диффундирует или транспортируется в водянистый юмор. Сопряженным с этим движением HCO3− является поток воды через эндотелиальные клетки в водянистый юмор. Поскольку эта система транспорта ионов частично зависит от клеточной энергии, охлаждение роговицы приводит к ее утолщению и помутнению. Однако возвращение роговицы к нормальной температуре тела приводит к восстановлению ее нормальной толщины и прозрачности — явление, известное как температурная реверсия.
Loss of or damage to corneal endothelial cells results in increased imbibition of water by the corneal stroma. The endothelial cells contain ion transport systems that counteract the imbibition of water into the stroma. An osmotic gradient of Na+ is present between the aqueous humor (143 mEq/L) and the stroma (134 mEq/L). This gradient results in the flow of Na+ from the aqueous humor to the stroma and in a flux of K+ in the opposite direction. The Na+- and K+-dependent ATPase and the Na+/H+ exchanger are expressed in the basolateral membrane of corneal endothelial cells. Carbon dioxide also diffuses into the cytoplasm of these cells and, together with water, generates bicarbonate ions (HCO3−) in a reaction catalyzed by carbonic anhydrase. The HCO3− then diffuses or is transported into the aqueous humor. Coupled with this movement of HCO3− is a flux of water across endothelial cells into the aqueous humor. Given that this ion transport system is partially dependent on cellular energy, cooling of the cornea results in its thickening and in it becoming opaque. The return of the cornea to normal body temperature, however, results in restoration of its normal thickness and clarity in a phenomenon known as temperature reversal.
Эндотелиальные клетки роговицы практически не пролиферируют у людей, обезьян и кошек, но делятся у кроликов. Плотность эндотелиальных клеток в нормальной здоровой роговице снижается с возрастом.[122] Важно, чтобы эндотелиальные клетки роговицы были защищены во время операции. Потеря эндотелиальных клеток по любой причине приводит к увеличению оставшихся соседних клеток и их распластыванию для закрытия дефектной области без увеличения количества клеток. Показатели зеркальной микроскопии колеблются по мере того, как поврежденный эндотелий восстанавливается за счет миграции и увеличения оставшихся эндотелиальных клеток. Коэффициент вариации средней площади клеток является наиболее чувствительным индексом дисфункции эндотелия роговицы, в то время как гексагональность является хорошим индексом прогресса заживления ран эндотелия.
Corneal endothelial cells essentially do not proliferate in humans, monkeys, and cats, but they do divide in rabbits. Endothelial cell density in the normal healthy cornea decreases with age.[122] It is important that corneal endothelial cells are protected during surgery. The loss of endothelial cells for any reason results in enlargement of the remaining neighboring cells and their spreading to cover the defective area, without an increase in cell number. The indices based on specular microscopy fluctuate as endothelial damage is resurfaced by the migration and enlargement of the remaining endothelial cells. The coefficient of variation of mean cell area is the most sensitive index of corneal endothelial dysfunction, whereas hexagonality is a good index of the progress of endothelial wound healing.
Поддержание нормальной целостности роговицы
Maintenance of Normal Corneal Integrity
Поддержание нормальной целостности роговицы
Maintenance of Normal Corneal Integrity
Обзор
Overview
Поддержание структуры роговицы имеет решающее значение для физиологической роли этой ткани в рефракции и биозащите. Гладкий эпителий, прозрачная строма и функционирующий эндотелий необходимы для четкого зрения. Роговица уязвима для различных химических или биологических агентов, а также для физических воздействий внешнего мира. Поэтому она оснащена активной системой поддержания, отвечающей за обновление эпителия роговицы и заживление ран.
Maintenance of corneal structure is crucial for the physiological roles of this tissue in refraction and biodefense. A smooth epithelium, a transparent stroma, and a functioning endothelium are all essential for clear vision. The cornea is vulnerable to various chemical or biological agents as well as physical events in the outside world. It is, therefore, equipped with an active maintenance system responsible for renewal of the corneal epithelium and wound healing.
Широкое применение хирургии роговицы, включая кератопластику и рефракционную хирургию, потребовало более детального понимания последних достижений в клеточной и молекулярной биологии заживления ран роговицы. В большинстве частей тела заживление ран инициируется экстравазацией компонентов крови, которая сопровождает повреждение кровеносных сосудов. Однако роговица является аваскулярной тканью. Таким образом, механизм заживления ран в роговице отличается от механизмов в других частях тела.
The widespread application of corneal surgery, including keratoplasty and refractive surgery, has necessitated a more detailed understanding of recent advances in cellular and molecular biology of corneal wound healing. In most parts of the body, wound healing is initiated by the extravasation of blood constituents that accompanies disruption of blood vessels. The cornea, however, is an avascular tissue. The mechanism of wound healing in the cornea thus differs from that elsewhere in the body.
Поддержание эпителия
Epithelial maintenance
Роль лимбальных стволовых клеток
Role of limbal stem cells
Эпителиальные клетки роговицы постоянно обновляются для поддержания нормальной слоистой структуры эпителия. Было хорошо продемонстрировано центрипетальное движение эпителиальных клеток роговицы, а также тот факт, что только базальные эпителиальные клетки способны к пролиферации. Тофт и Френд предположили, что существует равновесие между центрипетальным движением эпителиальных клеток, дифференцировкой базальных клеток в поверхностные и десквамацией эпителиальных клеток с поверхности роговицы (гипотеза X, Y, Z).[123] Также было постулировано существование стволовых клеток эпителия роговицы в области лимба.[124] Действительно, лимбальный эпителий проявляет более высокую пролиферативную активность и более низкую способность к дифференцировке, чем эпителий роговицы, и считается, что базальные эпителиальные клетки лимба представляют собой тип недифференцированных стволовых клеток, поскольку они не экспрессируют специфичный для эпителия роговицы кератин (кератин 3/12).[125]
Corneal epithelial cells renew continuously to maintain the normal layered structure of the epithelium. The centripetal movement of corneal epithelial cells has been well demonstrated, as has the fact that only the basal epithelial cells are capable of proliferation. Thoft and Friend proposed that an equilibrium exists between the centripetal movement of epithelial cells, the differentiation of basal cells into superficial cells, and the desquamation of epithelial cells from the corneal surface (X, Y, Z hypothesis).[123] The existence of corneal epithelial stem cells at the limbus has also been postulated.[124] Indeed, the limbal epithelium exhibits a higher proliferative activity and a lower differentiation capability than those of the corneal epithelium, and basal limbal epithelial cells are thought to be a type of undifferentiated stem cell because they do not express corneal epithelium-specific keratin (keratin 3/12).[125]
Базальные эпителиальные клетки лимба человека экспрессируют различные возможные маркеры стволовых клеток.[126] Было также показано, что экспрессия p63, α-енолазы, кератина 5/14 и рецептора фактора роста гепатоцитов (HGF) выше в лимбальном эпителии, чем в эпителии роговицы. Хотя прямых доказательств существования лимбальных стволовых клеток на сегодняшний день не получено, ABCG2 представляется наиболее перспективным поверхностным маркером для идентификации таких клеток. Было высказано предположение, что дефицит лимбальных стволовых клеток приводит к нарушению гомеостаза эпителия роговицы у лиц с аниридией, воспалительными заболеваниями поверхности глаза, такими как синдром Стивенса-Джонсона, или тяжелыми химическими ожогами поверхности глаза щелочью.[127]
Basal epithelial cells of the human limbus express various possible stem cell markers.[126] The expression of p63, a-enolase, keratin 5/14, and the hepatocyte growth factor (HGF) receptor has also been shown to be higher in the limbal epithelium than in the corneal epithelium. Although no direct evidence for the existence of limbal stem cells has been obtained to date, ABCG2 appears to be the most promising surface marker for the identification of such cells. Deficiency of limbal stem cells has been suggested to result in impairment of corneal epithelial homeostasis in individuals with aniridia, inflammatory disorders of the ocular surface such as Stevens–Johnson syndrome, or severe alkali burn of the ocular surface.[127]
Движение эпителия
Epithelial movement
Повреждение поверхности роговицы встречается нередко и приводит к образованию эпителиального дефекта, быстрое закрытие которого необходимо для восстановления непрерывности эпителия роговицы. Восстановление эпителиальных дефектов происходит в три отчетливые фазы, характеризующиеся миграцией, пролиферацией и дифференцировкой эпителиальных клеток, что приводит к восстановлению слоистой структуры эпителия.
Injury to the corneal surface is not uncommon and results in an epithelial defect, the rapid resurfacing of which is required for restoration of the continuity of the corneal epithelium. Repair of epithelial defects occurs in three distinct phases characterized by epithelial cell migration, proliferation, and differentiation, resulting in restoration of the stratified structure of the epithelium.
Таким образом, миграция эпителия является начальным этапом восстановления эпителиальных дефектов.[128] Повреждение эпителия роговицы вызывает скольжение и миграцию оставшихся эпителиальных клеток, прилегающих к месту повреждения, в сторону дефектной области.[129–132] Динамические изменения в межклеточных взаимодействиях и взаимодействиях клеток с матриксом (система фибронектин-интегрин), повышение экспрессии гиалуронана и модуляция внеклеточного матрикса (ВКМ) вновь экспрессируемыми протеолитическими ферментами играют важную роль в этих двух типах перемещения эпителиальных клеток в ответ на повреждение. Такие изменения находятся под общим контролем факторов роста и цитокинов.
Epithelial migration is thus the initial step in the resurfacing of epithelial defects.[128] Trauma to the corneal epithelium induces the sliding and migration of the remaining epithelial cells adjacent to the injury site toward the defective area.[129–132] Dynamic changes in cell–cell and cell–matrix (fibronectin–integrin system) interactions, up-regulation of hyaluronan, and modulation of the ECM by newly expressed proteolytic enzymes play important roles in these two types of epithelial cell movement in response to injury. Such changes are under the overall control of growth factors and cytokines.
Система фибронектин-интегрин
Fibronectin–integrin system
Фибронектин обеспечивает временный матрикс во время первой фазы заживления эпителиальных ран во многих тканях.[133] Фибронектин появляется на вновь обнаженной поверхности роговицы вскоре после повреждения эпителия или стромы,[118],[119] и затем эпителиальные клетки прикрепляются к матриксу фибронектина и распространяются по нему.[79,134,135]
Fibronectin provides a provisional matrix during the first phase of epithelial wound healing in many tissues.[133] Fibronectin appears at the newly exposed corneal surface soon after epithelial or stromal injury,[118],[119] and epithelial cells then attach to and spread over the fibronectin matrix.[79,134,135]